Uno de los organismos más estudiados en el
campo de la genética para el tema de las mutaciones es la
mosca del vinagre Drosophila melanogaster. En el estado
salvaje es una pequeña mosca diploide cuyo tamaño es
aproximadamente la tercera parte de una mosca doméstica. El
ciclo de vida del díptero Drosophila melanogaster incluye las
etapas de huevo, larva pupa y adulto, a partir del huevo, los
primeros hechos embrionarios producen en estado larvario
conocido como I instar, con un crecimiento rápido; la larva
muda 2 veces /II III instar), y entonces se forma el estado de
pupa, en el cual la cutícula de la larva es remplazada por
las estructuras adultas y un imago. Un adulta emerge de la cáscara
de la pupa listo para aparearse, en el caso del
macho.(Strickberger, 1978).
Drosophila melanogaster posee cuatro pares de cromosomas, de
los cuales: el par I es sexual siendo en la hembra (XX), largo
y telocéntrico, mientras que en el macho, uno largo y telocéntrico
(X) y otro corto y acrocéntrico; los pares II y III, son
Largos y metacéntricos; y el par IV, corto y telocéntrico.
La asignación de cromosomas X y Y en el cariotipo de D
melanogaster fue realizada por Wilson y Stewens, quienes
vieron en la hembra dos cromosomas largos X, en el macho uno
solo y un cromosoma corto Y (Puertas, 1992)
Se ha determinado el sexo homogamético a
la hembra por la presencia de dos gametos iguales (XX) y
heterogamético al macho, que solo posee un cromosoma X. En
especies con machos heterogaméticos como Drosophila los
descendientes machos sus cromosomas X solamente de sus madres
(Strickberger, 1988)
Drosophila melanogaster tiene un número
cromosómico bajo (2n = 8) y sus larvas presentan cromosomas
gigantes en sus glándulas salivares por lo que es de gran
utilidad para estudiar la morfología cromosómica y la
evolución cariotípica. Además se cuentan con gran cantidad
de líneas mutantes que producen fenotipos claros tales como
los que muestran diferencias en forma, color y tamaño de
diversas partes de su cuerpo entre otras.
Por tales motivos, Drosophila melanogaster
es un organismo ideal para la demostración de muchos
principios biológicos y el análisis de ciencia descriptiva,
bioquímica y molecular, se utiliza para estudiar problemas de
desarrollo y nutrición fisiológicas y conducta animal,
comportamiento, reacciones en el apareamiento y respuestas a
la luz de diversos colores.
Dada la variación de mutaciones que
presenta la Drosophila melanogaster se ha escogido como
material biológico preferido para estudiar el fenómeno de la
herencia. Existen varios factores que contribuyen a su elección
como organismo adecuado para la demostración de muchos
principios genéticos en eucariotas, como son: Su bajo número
de cromosomas (4 pares), la disponibilidad de una gran
variedad de mutaciones, su fácil mantenimiento en el
laboratorio, y su corto período generacional. (Carrera y
Rueda, 1995)
Para la realización de este trabajo se
utilizaron mutantes específicos tales como hembras
yellow-white y machos salvajes para cruces hasta la segunda
generación filial cuyos resultados fueron sometidos a un análisis
cuantitativo y cualitativo con base en pruebas estadísticas y
utilizando la teoría como base para el análisis reflexivo de
los resultados obtenidos
Marco teórico
Los primeros estudios acerca de los mecanismos de la
herencia, son atribuidos a Gregorio Mendel quien por primera
vez utiliza diferentes variedades del tipo de guisantes para
formular toda una experimentación cuantitativa basado en un
procedimiento científico capaz de darle explicación a las
observaciones cotidianas que apuntaban a la existencia de un
proceso complejo de herencia. Sus trabajos fueron
redescubiertos en 1900, son la base fundamental de la Genética
Moderna, pues constituyen la primera aproximación lógica,
descriptiva y racional del estudio de los mecanismos de la
herencia.
Mendel formuló dos grandes leyes; la primera expone que los
miembros de la pareja genética se distribuyen separadamente
entre los gametos (segregan), de forma que la mitad de los
gametos llevan un miembro de la pareja génica y la otra mitad
llevan el otro miembro de la pareja génica. Las proporciones
fenotípicas que obtuvo Mendel para la segunda generación
filial fueron de 3:1.(Griffiths, 1995, p.27)
En su segunda Ley, Mendel propone que:
"Durante la formación de los gametos, la segregación de
los alelos de un gen se produce de manera independiente de la
segregación de los alelos de otro gen". Las proporciones
fenotípicas para la segunda generación filial fueron
9:3:3:1.(Griffiths, 1995, p.30.)
A Mendel se le atribuye haber establecido
las reglas básicas del análisis genético, ya que su trabajo
permitió conocer la existencia de unidades hereditarias, que
contenían la información hereditaria que se transmitía de
una generación a otra. Los términos dominante y recesivo
fueron acuñados por Mendel, los mismos se mantienen en la
actualidad; a las unidades hereditarias las denominó factores
En 1912 Sutton y Boveri, propusieron la teoría cromosómica
de la herencia, que estableció que los factores de Mendel
eran los genes ubicados en una estructura definida llamada
cromosoma y que estos los genes, estaban ubicados sobre los
cromosomas. Los trabajos de estos investigadores fueron
reforzados y esclarecidos por los trabajos de Morgan quien
estudió los mecanismos de la herencia, utilizando mutaciones
en Drosophila melanogaster como marcadores genéticos, que le
permitieron observar y entender estos procesos.
No obstante, mientras Mendel Solo necesitó obtener 34
variedades de semillas, Morgan tenía que generar sus propias
variedades de organismos. Morgan esperaba que diferentes
variedades o mutantes del tipo silvestre aparecieran y así
cruzar las suficientes cantidades de moscas. En un año
aproximadamente, y entre miles de moscas, encontró su primer
mutante, tenía ojos blancos, en lugar de rojos como era la
normal.
Posteriormente T.H. Morgan, en 1910,
presentó pruebas de que un carácter específico de
Drosophila melanogaster, ojos blancos, se hallaba ligado a la
herencia del sexo y muy probablemente asociado a un cromosoma
determinado, el cromosoma X. Según los datos de Morgan en un
cultivo normal de moscas de ojos rojos había apreciado que un
macho de ojos blancos que entonces fue cruzado con sus
hermanas de ojos rojos, todos los individuos de la F1 de dicho
cruzamiento presentaban los ojos rojos con excepción de tres
machos con ojos blancos que Morgan atribuyó a mutaciones
posteriores. Lo que presentaba un interés especial era el
hallazgo de que al cruzar entre sí las moscas con ojos rojos
de la F1 daban lugar a hembras con los ojos blancos.
Sin embargo, aparecían hembras con los
ojos blancos al efectuar el cruzamiento retrógrado de las
hembras con ojos rojos de F1 con el progenitor masculino de
ojos blancos, este último tipo de cruzamiento dio lugar a
cuatro clases de descendiente, hembras y machos de ojos
blancos, hembras y machos de ojos rojos.
Para dar explicación a estos resultados Morgan propuso que
las hembras de la F1 de ojos rojos eran heterocigotas para el
carácter ojos blancos, recesivo. De este modo la aparición
de hembras de ojos blancos solo podía darse en las hembras
homocigotas para el gen white. Por otra parte, un descendiente
masculino tenía la misma probabilidad de tener los ojos rojos
que blancos si su madre era un heterocigoto sin reportar el
genotipo de su padre. Estos resultados se relacionan con los
hallazgos de Wilson, Stevens y otros de que el macho sólo tenía
un cromosoma X y la hembra dos.
Según esto, el macho original de ojos
blancos tenía un gen white localizado en un cromosoma X único,
aunque white es recesivo ese macho presentaba de todas formas
los ojos blancos a causa de la ausencia de otro cromosoma X
normal. Sin embargo, en las hembras el color de los ojos
depende de los genes presentes en los dos cromosomas X y sólo
pueden presentarse ojos blancos cuando ambos cromosomas X
llevan el gen recesivo white.
Un factor de gran interés en el estudio de
la genética, son las mutaciones, según Griffiths (1995)
"las mutaciones son cambios que se dan en los organismos
de un estado hereditario a otro".
Las mutaciones han constituido una herramienta fundamental en
el estudio genético, pues se han convertido en verdaderos
marcadores especiales que permiten seguir los procesos biológicos
y se pueden utilizar con dos propósitos (1) para estudiar el
proceso de mutación por si mismo y (2) para analizar una
función biológica desde un punto de vista genético.
Las mutaciones más fáciles de detectar son las mutaciones
morfológicas, que afectan al color o la forma de cualquier órgano
de un animal o planta, pues son rápidamente visibles y
medibles.(Puertas, 1992).
Los estudios de mutaciones estudios han
permitido evidenciar situaciones en las cuales las Leyes de
Mendel se ven alteradas en las proporciones fenotípicas, como
lo son las interacciones alélicas que se dan entre alelos de
un mismo gen, por ejemplo la codominancia la dominancia
incompleta, pleiotropía, dominancia completa, y las
interacciones no alélicas que surgen entre alelos de
diferentes genes como las epístasis.
Otro tipo de situaciones que afectan las proporciones fenotípicas
de Mendel son las referidas a la existencia de ligamientos físicos
absolutos y parciales. El ligamiento es una concepción que
surge del estudio de ubicación y observación de los genes en
los cromosomas, estableciendo que si dos genes se encuentran
en un mismo cromosoma estarán ligados físicamente por lo
cual no podrán segregar de forma independiente uno del otro
tal como lo exponía Mendel. El ligamiento constituye entonces
un mecanismo que permitió explicar aquellas situaciones donde
las leyes de Mendel no podían explicar los procesos de la
herencia.
Con el estudio detallado de los procesos de
herencia y el establecimiento de los procesos de Mitosis y
Meiosis, se determinó que durante la Meiosis los cromosomas
homólogos eran capaces de intercambiar material genético,
proceso al que se denominó recombinación, y que se ve
evidenciado en la formación de estructuras visibles llamadas
quiasmas. Para que ocurra la recombinación deberán acontecer
una serie de procesos que lleven a la formación del complejo
sinaptonémico, que mantendrá unidos a los cromosomas homólogos
y permitirá el intercambio de material genético entre estos.
La hembra en Drosophila melanogaster, constituye el sexo
homogamético, puede recombinar ya que presenta ligamiento que
le permiten poder romper porciones del cromosoma y establecer
quiasmas para el intercambio de material genético. En el
macho, que constituye el sexo heterogamético, existe un
ligamiento absoluto que impide la recombinación por no darse
los procesos de rompimientos cromosómico, esenciales para el
intercambio de material genético.
La recombinación en un proceso que puede
influir en la herencia, los estudios han determinado que los
gametos que resultan de la recombinación siempre serán en
frecuencia menor a los que llevan genes donde no se ha dado la
recombinación, es decir, los parentales. Sturtevant, propuso
la existencia grosso modo de la siguiente proporcionalidad:
conforme mayor es la distancia entre genes ligados, mayor es
la probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento entre cromátidas
no hermanas en la zona que separa esos genes y, por lo tanto,
mayor la proporción de recombinantes que se producen.
En el estudio experimental y teórico de los procesos de la
herencia, se ha desarrollado métodos matemáticos y estadísticos
que tienen como objeto realizar comprobaciones de fenómenos
en estudio, tal es el caso de cruces experimentales en
Drosophila melanogaster.
Planteamiento del cruce entre hembras
yellow-white (yw) y machos salvajes(y+w+)
Con La finalidad de demostrar fenómenos que difieren
de los principios Mendelianos, se realizó un cruce con 2
hembras yw y 5 machos salvajes
Las hembras son vírgenes con mutaciones en el cromosoma I
sexual en el locus 0.0 (yellow) y 1.5 (white) siendo
silvestres para los demás locus, y los machos son salvajes o
normales para todos los locus.
Las mutaciones yellow-white están ligadas al sexo por lo que
se encontrará segregación no independiente entre los genes
yellow-white por estar físicamente ligados (en el mismo
cromosoma) y dominancia completa de los alelos salvajes sobre
los mutantes.
Se utilizaron mutantes de cepas específicas como hembras
yellow-white y machos salvajes, para cruces hasta la segunda
generación filial, posteriormente los resultados fueron
analizados con base en un análisis cuantitativo y
cualitativo, basándose en pruebas estadísticas y utilizando
la teoría como basa para su análisis.
Objetivos
Objetivo general.-
-
Plantear y realizar cruces
experimentales con D. melanogaster, con la finalidad de
demostrar, interacciones génicas, herencia ligada al
sexo, ligamiento y recombinación.
Objetivos específicos.-
-
Demostrar que las mutaciones yellow (y)
y white (w), al estar ubicadas en el mismo cromosoma,
segregan de forma dependiente.
-
Demostrar que las mutaciones (y) y (w),
son caracteres ligados al sexo
-
Demostrar la presencia de herencia
cruzada
-
Determinar los tipos de gametos
posibles en cruces genéticos y calcular las frecuencias
gaméticas esperadas.
-
Determinar si se presentan
recombinantes y cual es su proporción
-
Demostrar si los descendientes
parentales son más numerosos que los descendientes
recombinantes
-
Determinar frecuencia genotípicas y
fenotípicas esperadas hasta la segunda generación
filial.
-
Determinar si las descendencias
esperadas en la F1 y F2 y comparar
con las descendencias observadas.
-
Verificar la validez de la hipótesis
planteadas para la F1 y F2, a través
de la aplicación de la prueba chi cuadrado.
Hipótesis
Primera generación Filial (F1)
Al realizar el cruce experimental donde las hembras son yw
homogaméticas y los machos y+w+ heterogaméticos,
cuyos genes para la mutación yw son recesivas y están
ubicados en el cromosoma I (sexual) X; es de esperarse que en
la primera generación filial, todos los machos expresen el
fenotipo de la madre (yw) y todas las hembras sean salvajes
expresando el fenotipo del padre (y+w+
), evidenciando así herencia cruzada.
Segunda generación filial (F2)
Al realizar un segundo cruce (endocruce), entre individuos de
la primera generación filial cuyas hembras son homocigotas y
los machos hemicigotos, para cualquier carácter ligado al
sexo, es de esperarse que ocurra segregación dependiente.
En el cruce para los genes considerados "y" y
"w", los cuales se encuentran en el mismo cromosoma
(X), es de esperarse ligamiento físico, interacciones no alélicas
y ligamiento al sexo, siendo más frecuentes estas mutaciones
(yw en los machos, así como también proporciones fenotípicas
de diferentes caracteres como Yellow-white (yw), salvajes (y+w+
),yellow (y w+ ) y white (y+ w).
Por encontrarse los locus 0.0 "y" y 1.5
"w" muy cercanos en el mapa genético del cromosoma
X, es de esperarse que la probabilidad de recombinación sea mínima.
Materiales
Sustancias e instrumental
-
Frascos de vidrio con tapones y medio
de cultivo
-
Frascos de vidrio vacíos con tapones
-
Lupa estereoscópica
-
Agujas de disección
-
Frasco eterizador
-
Cápsula de petri
-
Tubo transportador
-
Pincel fino de cerdas naturales
-
Placas de porcelana
-
Almohadilla de anime
-
Eter dietílico
-
Morgue ( frasco de vidrio con aceite de
motor )
Biológicos
-
Lineas mutantes de Drosophila
melanogaster
-
Dos (2) hembras vírgenes yellow-white
-
Cinco (5) machos salvajes
Descripcion y designacion de las lineas
mutantes
y : yellow ( I-0.0 )- cuerpo
Origen : espontáneo
Descubrió : E. Wallace
Fenotipo : cuerpo amarillo, pelos y cerdas café con puntas
amarillas. Las setas y las partes bucales de la larva son café,
distinguibles del café oscuro del tipo silvestre.
w : white ( I-1.5 ) - ojos
Origen: espontáneo
Descubrió: Morgan
Fenotipo: ojos color blanco puro. Los ocelos, la cubierta de
los testículos de adultos y los tubos de Malpighi de las
larvas son incoloros. Los alelos de tipo silvestre no dominan
completa sobre white, w/+ tiene menos pigmento rojo que +/+.
Para llevar a cabo estudios experimentales
con Drosophila melanogaster se utilizaron dos (2) hembras vírgenes
yellow-white y cinco (5) machos con el fenotipo salvaje,
observando con detenimiento las características de estas
moscas al presentar estas mutaciones. Para observarlas se
utilizó la técnica del blanqueo, que permite narcotizar al
grupo de moscas de un cultivo determinado para observarlas
mientras se encuentran dormidas.
Procedimiento para narcotizar y transportar
Drosophila melanogaster.
1.- En un frasco limpio y vacío con un tapón de algodón
previamente impregnado con 5 ó 6 gotas de éter dietílico,
se esperan 2 minutos mientras se formaba una atmósfera de éter
en el interior del mismo, construyéndose así el frasco
eterizador.
2.- Se golpeaba firmemente 2 ó 3 veces el frasco de cultivo,
(tomando en cuenta las condiciones del cultivo) sobre una lámina
de anime, de manera que las moscas pasaran a la parte inferior
del frasco. Este paso se realizó con mucho cuidado a fin de
evitar que el frasco se rompa o que las moscas se precipiten
contra el medio y queden pegadas a él, lo que ocasionaría su
muerte.
3.- Inmediatamente y en forma rápida se procedió a destapar
ambos frascos colocándolos boca a boca ubicando el eterizador
en la parte superior. Los tapones de los frascos debían
siempre estar agarrados por el responsable del blanqueo para
evitar la contaminación de los mismos.
4.- Se invirtió la posición de los frascos, haciendo que el
frasco eterizador quedara en la parte que hace contacto con el
anime. Se golpea suavemente unas dos o tres veces de manera
que todas las moscas del medio de cultivo pasaran al frasco
eterizador.
5.- Se tapaban inmediatamente los dos frascos con sus
respectivos tapones, y se esperaban unos segundos a que las
moscas se durmieran para empezar a observarlas.
6.- Con ayuda de un pincel fino se transportaba y manipulaba a
las moscas del frasco eterizador a las lupas, láminas o cápsula
narcotizantes.
7.- Una vez dormidas se transportaron a la baldosa y se
observaron a la lupa, si se evidenciaba que las moscas estaban
despertando, se utilizaba una cápsula de petri con un pedazo
de gasa con unas gotas de éter para tapar el área donde se
encontraban las moscas y volverlas a dormir.
Eliminación de moscas: Si se desea
transportar algunas moscas que quedaron en el cultivo, se
utilizaba el transportador, que son tubos de vidrio con
extremo en bisel y el otro conectado a una manguera, entre la
manguera y la boquilla se coloca una gasa que impida el paso
de moscas, este transportador permitía succionar las moscas y
mantenerlas en un sitio determinado cerrando el extremo en
bisel del transportador, para posteriormente; por un lado del
tapón del cultivo insertarlas sin necesidad de abrir el
frasco del cultivo, o de sacarlas sin necesidad de realizar un
nuevo blanqueo.
Selección de hembras vírgenes
Para ello existen tres métodos diferentes:
a.- Colectas a partir de imagos: este se da en un ciclo de
diez días, el primer día se siembra la línea de moscas, el
quinto se retira a los progenitores para evitar que se
confundan con la progenie; luego el décimo día se eliminan
las moscas que hayan emergido durante la noche. Se procede a
separar hembras y machos, se colocan las primeras en medio
fresco y se elimina a los machos
b.- Colecta a partir de larvas del tercer estadio: para ello
se recurre a la observación de las gónadas larvarias (que
son de distinto tamaño en ambos sexos) utilizando un
microscopio de disección a 4x o 10x. Una vez colectadas las
hembras se colocarán en frascos con medio fresco para que
completen su desarrollo.
c.- Colecta a partir de pupas: Ya que el sexo puede
determinarse si se examina la superficie ventral de esta con
ayuda de un microscopio de disección. En las pupas machos
() se distingue los peines sexuales, lo que facilita
este método. Cabe mencionar que este fue el método utilizado
por la profesora para la colecta de hembras vírgenes, las
cuales fueron entregadas a cada equipo de trabajo para su
estudio y experimentación.
Procedimiento para el cruce
experimental
A.- Montaje del cruce P1 x P1:
Para este primer cruce se colocaron en un frasco con medio
de cultivo 2 hembras vírgenes (yw) y 5 machos salvajes, estas
moscas constituyeron nuestra primera generación parental. Al
cabo de 8 días, se eliminaron los padres; encontrándose
muchas larvas que se constituirían en las moscas de la
primera generación filial, se examinó meticulosamente el
fenotipo de cada una, realizándose el primer conteo de machos
y hembras.
B.- Montaje del Endocruce F1 x F1:
Se tomaron 8 hembras héterocigotas en representación de
la primera generación filial, y se cruzaron con 16 machos
hemicigotos en representación de la primera generación
filial, se transportaron a un nuevo medio de cultivo, y se
identificó fecha, características y tipo de cruce realizado.
Al cabo de ocho días se retiraron los padres, comprobando que
existían suficientes larvas y pupas en el frasco, el día 16
luego de montado el endocruce se realizó el primer conteo de
la segunda generación filial, determinando los fenotipos y
sexos de las moscas adultas emergidas en este endocruce, a los
8 días posteriores se realizó el segundo conteo,
determinando los mismos elementos.